PCR, on polümeraasi ahelreaktsioon, mis viitab dNTP, Mg2+, elongatsioonifaktorite ja amplifikatsiooni võimendusfaktorite lisamisele süsteemi DNA polümeraasi katalüüsi all, kasutades algset DNA-d matriitsina ja spetsiifilisi praimereid pikendamise lähtepunktina. Denatureerimise, anniilimise, pikendamise jne etappide kaudu võib algahela matriitsi DNA-ga komplementaarse tütarahela DNA in vitro replikatsiooniprotsess kiiresti ja spetsiifiliselt amplifitseerida mis tahes sihtmärk-DNA-d in vitro.
1. Hot Start PCR
Amplifikatsiooni algusaeg tavapärases PCR-is on mitte panna PCR-masinat PCR-masinasse ja siis hakkab programm amplifitseerima.Kui süsteemi konfigureerimine on lõpule viidud, algab amplifikatsioon, mis võib põhjustada mittespetsiifilist amplifikatsiooni, ja kuumkäivitusega PCR võib selle probleemi lahendada.
Mis on kuumkäivituse PCR?Pärast reaktsioonisüsteemi valmistamist vabaneb ensüümi modifikaator kõrgel temperatuuril (tavaliselt kõrgemal kui 90 °C) reaktsiooni algses kuumutamisetapis ehk "kuumkäivituse" etapis, nii et DNA polümeraas aktiveerub.Täpne aktiveerimisaeg ja temperatuur sõltuvad DNA polümeraasi ja kuumkäivituse modifikaatori olemusest.See meetod kasutab DNA polümeraasi aktiivsuse pärssimiseks peamiselt modifikaatoreid, nagu antikehad, afiinsusligandid või keemilised modifikaatorid.Kuna DNA polümeraasi aktiivsus on toatemperatuuril inhibeeritud, pakub kuumkäivitustehnoloogia suure mugavuse mitme PCR reaktsioonisüsteemi valmistamiseks toatemperatuuril ilma PCR reaktsioonide spetsiifilisust ohverdamata.
2. RT-PCR
RT-PCR (pöördtranskriptsiooni PCR) on eksperimentaalne meetod mRNA-st cDNA-ks pöördtranskriptsiooniks ja selle kasutamiseks amplifikatsiooni matriitsina.Eksperimentaalne protseduur seisneb esmalt kudedes või rakkudes kogu RNA ekstraheerimises, praimerina Oligo (dT) kasutamises, cDNA sünteesimiseks pöördtranskriptaasi kasutamises ja seejärel cDNA-s PCR amplifikatsiooni matriitsina sihtgeeni saamiseks või geeniekspressiooni tuvastamiseks.
3. Fluorestseeruv kvantitatiivne PCR
Fluorestseeruv kvantitatiivne PCR (reaalajas kvantitatiivne PCR,RT-qPCR) viitab meetodile fluorestseeruvate rühmade lisamiseks PCR reaktsioonisüsteemi, kasutades fluorestseeruvate signaalide akumulatsiooni kogu PCR protsessi reaalajas jälgimiseks ja lõpuks standardkõvera kasutamist matriitsi kvantitatiivseks analüüsimiseks.Tavaliselt kasutatavad qPCR meetodid hõlmavad SYBR Green I ja TaqMan.
4. Pesastatud PCR
Pesastatud PCR viitab kahe PCR praimerite komplekti kasutamisele kahe PCR amplifikatsiooni vooru jaoks ja teise ringi amplifikatsiooniprodukt on sihtgeeni fragment.
Kui esimese praimerite paari (välimiste praimerite) mittevastavus põhjustab mittespetsiifilise produkti amplifitseerimise, on võimalus, et teine praimerite paar tuvastab sama mittespetsiifilise piirkonna ja jätkab amplifitseerimist, väga väike, nii et amplifikatsioon teise praimerite paariga, on PCR spetsiifilisus paranenud.Kahe PCR-i vooru üks eelis on see, et see aitab amplifitseerida piisavalt produkti piiratud lähte-DNA-st.
5. Maandumise PCR
Touchdown PCR on meetod PCR reaktsiooni spetsiifilisuse parandamiseks, kohandades PCR tsükli parameetreid.
Touchdown PCR-is seatakse esimeste tsüklite anniilimistemperatuur mõne kraadi võrra kõrgemale praimerite maksimaalsest anniilimistemperatuurist (Tm).Kõrgem anniilimistemperatuur võib tõhusalt vähendada mittespetsiifilist amplifikatsiooni, kuid samal ajal raskendab kõrgem anniilimistemperatuur praimerite ja sihtjärjestuste eraldamist, mille tulemuseks on PCR-i saagise vähenemine.Seetõttu on esimestel tsüklitel anniilimistemperatuur tavaliselt langetatud 1 °C võrra tsükli kohta, et suurendada sihtgeeni sisaldust süsteemis.Kui lõõmutamistemperatuuri alandatakse optimaalsele temperatuurile, säilitatakse lõõmutamistemperatuur ülejäänud tsüklite jooksul.
6. Otsene PCR
Otsene PCR viitab sihtmärk-DNA amplifikatsioonile otse proovist ilma nukleiinhappe eraldamise ja puhastamise vajaduseta.
Otsest PCR-i on kahte tüüpi:
otsene meetod: võtke väike kogus proovi ja lisage see PCR-i tuvastamiseks otse PCR Master Mix'i;
krakkimismeetod: pärast proovi võtmist lisage see lüsaadile, lüüsige genoomi vabastamiseks, võtke väike kogus lüüsitud supernatanti ja lisage see PCR Master Mixi, teostage PCR identifitseerimine.See lähenemisviis lihtsustab eksperimentaalset töövoogu, vähendab praktilist aega ja väldib DNA kadu puhastamisetappide ajal.
7. SOE PCR
Geeni splaissimine kattuva pikendusega PCR-iga (SOE PCR) kasutab komplementaarsete otstega praimereid, et PCR produktid moodustaksid kattuvad ahelad, nii et järgnevas amplifikatsioonireaktsioonis kattuvate ahelate pikendamise kaudu tekivad erinevad A-tehnika allikad, milles amplifitseeritud fragmendid kattuvad. ja kokku liidetud.Sellel tehnoloogial on praegu kaks peamist rakendussuunda: fusioongeenide ehitamine;geeni saidile suunatud mutatsioon.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) kasutab pöördkomplementaarseid praimereid, et amplifitseerida DNA fragmente peale kahe praimeri ja amplifitseerib tundmatuid järjestusi teadaoleva DNA fragmendi mõlemal küljel.
IPCR oli algselt kavandatud kõrvuti paiknevate tundmatute piirkondade järjestuse määramiseks ja seda kasutatakse enamasti geeni promootorjärjestuste uurimiseks;onkogeensed kromosoomi ümberkorraldused, nagu geenide liitmine, translokatsioon ja transpositsioon;ja viiruse geenide integratsioon, on praegu samuti levinud. Kohtsuunatud mutageneesi jaoks kopeerige soovitud mutatsiooniga plasmiid.
9. dPCR
Digitaalne PCR (dPCR) on meetod nukleiinhappemolekulide absoluutseks kvantifitseerimiseks.
Praegu on nukleiinhappemolekulide kvantifitseerimiseks kolm meetodit.Fotomeetria põhineb nukleiinhappemolekulide neeldumisel;reaalajas fluorestsents-kvantitatiivne PCR (Real Time PCR) põhineb Ct väärtusel ja Ct väärtus viitab tsükli numbrile, mis vastab tuvastatavale fluorestsentsi väärtusele;digitaalne PCR on uusim kvantitatiivne tehnoloogia, mis põhineb ühemolekulilisel PCR-meetodil nukleiinhapete loendamiseks. Kvantifitseerimine on absoluutne kvantitatiivne meetod.
Postitusaeg: 13. juuni 2023