Ultrafiltratsiooni tsentrifuugitoru kasutamine ja ettevaatusabinõud
1) Valige sobiv ultrafiltratsioonitoru.Pange tähele, et UF-membraanid erinevad erinevate kemikaalide taluvuse poolest.Tavaliselt saab 10 kDa molekulmassi piirväärtusega ultrafiltratsioonitorusid valida molekulmassi piirväärtusega, mis ei tohiks olla suurem kui 1/3 huvipakkuva valgu molekulmassist, näiteks 35 kDa.Kui huvipakkuva valgu molekulmass on umbes 10 kd, võib kasutada ultrafiltratsioonitoru, mille molekulmassi piirväärtus on 3 KD.
(2) Värskelt ostetud ultrafiltratsioon on kuiv, enne kasutamist on lisatud ülipuhast vett ja vesi on täielikult läbinud membraani, jäävanni või külmkapi, mis on mõneks minutiks eeljahutatud.Seejärel valatakse vesi ehk valguvedelik ära ja kui palju lisatakse, olenevalt sellest, kumb on mitte rohkem kui valge joon toru ülaosas.Toiming on kerge ja ultrafiltratsioonitoru tuleb enne valgulahuse lisamist jääl jahutada.
3) Nii mass kui ka raskuskese pidid jõudma tasakaalu.Pange tähele, et pöörlemiskiirus ja kiirendus ei ole väga kiired, vastasel juhul kahjustades otseselt ultrafiltratsioonimembraani.Alustati tsentrifugaalset ultrafiltreerimist (tsentrifuug eeljahutatud 4 kraadini).Pärast seda, kui erinevate tsentrifuugide pöörded muudeti g-ks, oli see erinev.Tsentrifuugi kiirendus viidi miinimumini, vähendades survet membraanile.Pange tähele, lahkuge kindlasti tsentrifuugist pärast seda, kui tsentrifuug on saavutanud sihtkiiruse või kui teil on probleem, ei saa te sellega esimest korda hakkama.Membraani orientatsioon spindli suhtes reguleeriti vastavalt juhistele (nurkne tsentrifuugi korpus on membraani teljega risti).Praktilisel kasutamisel on üldine pöörlemiskiirus väiksem kui juhendis, nii et tsentrifuugitoru eluiga saab pikendada.
3) Nii mass kui ka raskuskese pidid jõudma tasakaalu.Pange tähele, et pöörlemiskiirus ja kiirendus ei ole väga kiired, vastasel juhul kahjustades otseselt ultrafiltratsioonimembraani.Alustati tsentrifugaalset ultrafiltreerimist (tsentrifuug eeljahutatud 4 kraadini).Pärast seda, kui erinevate tsentrifuugide pöörded muudeti g-ks, oli see erinev.Tsentrifuugi kiirendus viidi miinimumini, vähendades survet membraanile.Pange tähele, lahkuge kindlasti tsentrifuugist pärast seda, kui tsentrifuug on saavutanud sihtkiiruse või kui teil on probleem, ei saa te sellega esimest korda hakkama.Membraani orientatsioon spindli suhtes reguleeriti vastavalt juhistele (nurkne tsentrifuugi korpus on membraani teljega risti).Praktilisel kasutamisel on üldine pöörlemiskiirus väiksem kui juhendis, nii et tsentrifuugitoru eluiga saab pikendada.
(4) Kui kontsentreeritakse järelejäänud 1 ml-ni, võtke 50 ul puhverlahust, lisage 10 ul läbivoolu ja vaadake, kas on sinist värvi, et hinnata, kas ultrafiltratsioonitorus pole valku.Kui toru lekib, valage ülemine kiht uuesti ja voolake ultrafiltrimise alustamiseks uude torusse.Katseklaaside vahelejäämise täpseks kindlakstegemiseks tsentrifuugige 10 minutit 5 mg BSA-ga enne läbivoolu, valguliimiga töötamist või Bradfordi tooranalüüsi ja jätkake ülejäänud kontsentreeritud valgulahuse lisamisega (mis töötab jääl ja takistab valkude kuumenemist), kuni kogu kontsentraat on lisatud.Olge tsentrifuugimise ajal ettevaatlik, kui toimub valkude sadestumine, mis põhjustab toru sulgemise.Sademete ilmnemisel tehke kindlaks, kas sademete konkreetne põhjus on liigne valgukontsentratsioon või sobimatu puhver;Esimest saab lahendada mitme ultrafiltratsioonitoru samaaegse ultrafiltreerimisega, vähendades kontsentratsiooni, ja teist, vahetades erinevaid puhverlahuseid, kuni valgu sadestumist ei toimu.
(4) Kui kontsentreeritakse järelejäänud 1 ml-ni, võtke 50 ul puhverlahust, lisage 10 ul läbivoolu ja vaadake, kas on sinist värvi, et hinnata, kas ultrafiltratsioonitorus pole valku.Kui toru lekib, valage ülemine kiht uuesti ja voolake ultrafiltrimise alustamiseks uude torusse.Katseklaaside vahelejäämise täpseks kindlakstegemiseks tsentrifuugige 10 minutit 5 mg BSA-ga enne läbivoolu, valguliimiga töötamist või Bradfordi tooranalüüsi ja jätkake ülejäänud kontsentreeritud valgulahuse lisamisega (mis töötab jääl ja takistab valkude kuumenemist), kuni kogu kontsentraat on lisatud.Olge tsentrifuugimise ajal ettevaatlik, kui toimub valkude sadestumine, mis põhjustab toru sulgemise.Sademete ilmnemisel tehke kindlaks, kas sademete konkreetne põhjus on liigne valgukontsentratsioon või sobimatu puhver;Esimest saab lahendada mitme ultrafiltratsioonitoru samaaegse ultrafiltreerimisega, vähendades kontsentratsiooni, ja teist, vahetades erinevaid puhverlahuseid, kuni valgu sadestumist ei toimu.
(5) Esimesi etappe kasutatakse valgu kontsentreerimiseks ja kui puhvrit tuleb muuta, lisage ettevaatlikult uus puhver (ultrafiltreerimine läbi 0,22 um ultrafiltratsioonimembraani) umbes 1 ml koguvalgule ja kontsentreerige uuesti umbes 1 ml-ni kolm korda. järjestikuseid kordi, kusjuures lõplik kontsentreeritud lõppmaht sõltub soovitud valgukontsentratsioonist, tavaliselt mitte rohkem kui 500 ul, aga ka 200 ul täpsusega.Saavutage kolmel korral 1000 × või rohkem, sisuliselt sama palju puhvri muutust, mis arvutatakse iga kord vähemalt 10 × mahu rikastamisega.
(5) Esimesi etappe kasutatakse valgu kontsentreerimiseks ja kui puhvrit tuleb muuta, lisage ettevaatlikult uus puhver (ultrafiltreerimine läbi 0,22 um ultrafiltratsioonimembraani) umbes 1 ml koguvalgule ja kontsentreerige uuesti umbes 1 ml-ni kolm korda. järjestikuseid kordi, kusjuures lõplik kontsentreeritud lõppmaht sõltub soovitud valgukontsentratsioonist, tavaliselt mitte rohkem kui 500 ul, aga ka 200 ul täpsusega.Saavutage kolmel korral 1000 × või rohkem, sisuliselt sama palju puhvri muutust, mis arvutatakse iga kord vähemalt 10 × mahu rikastamisega.
Postitusaeg: 09.11.2022